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Taller BCM - Glucólisis y destino del piruvato
III. Glucólisis y destinos del piruvato
Al finalizar el tema, el estudiante debe conocer los fundamentos teóricos referidos a:
Glucólisis: Aspectos generales de la vía, localización subcelular, reacciones, enzimas, etapas,
balance y regulación de la vía.
Fosfofructoquinasa: Cooperatividad y regulación por moduladores alostéricos.
Destinos del piruvato: Reacciones catalizadas por la piruvato deshidrogenasa y la lactato
deshidrogenasa. Localización subcelular de estas enzimas y rol en el metabolismo energético
celular. Mecanismo de reacción y regulación de la piruvato deshidrogenasa.
1. El esquema que se presenta muestra las reacciones que ocurren en el transcurso de la
oxidación de la glucosa a piruvato.
a) ¿Qué tipo de vía es la glucólisis?
b) Identifique la reacción óxido-reducción que ocurre en la glucólisis. ¿Cuál es la especie
que se reduce y cuál se oxida?
c) Identifique que tipo de transferencia de electrones ocurre en esta reacción y que
enzima la cataliza (ver Anexo en EVA).
d) Identifique las reacciones de fosforilación de la vía donde se consume ATP. Indique
cuales son los sustratos, productos y enzimas que catalizan estas reacciones.
e) Identifique las reacciones de fosforilación de la vía donde se produce ATP. Indique
cuales son los sustratos, productos y las enzimas que catalizan estas reacciones.
f) ¿Qué nombre reciben este tipo de reacciones de síntesis de ATP? ¿Qué otro
mecanismo de síntesis de ATP posee la célula?
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a) La glucólisis es una vía catabólica.
b) Las reacciones de óxido reducción implican transferencia de electrones, la
reacción 6 de la glucólisis es una reacción redox. El gliceraldehído 3-fosfato se
oxida y el NAD+ se reduce a NADH.
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c) Hay transferencia de un ión hidruro. La reacción es catalizada por la
gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa.
d) Las reacciones 1 y 3 de la glucólisis consumen ATP.
La hexoquinasa cataliza la reacción 1, los sustratos son la glucosa y el ATP,
mientras que los productos son la glucosa 6-fosfato y el ADP.
La fosfofructoquinasa 1 (PFK1) cataliza la reacción 3, los sustratos son la
fructosa 6-fosfato y el ATP, los productos son la fructosa 1,6-bifosfato y el
ADP.
e) Se produce ATP en las reacciones 7 y 10 de la vía.
La fosfoglicerato quinasa cataliza la reacción 7, los sustratos son el
1,3-bifosfoglicerato y el ADP, y los productos son el ATP y el 3-fosfoglicerato.
La piruvato quinasa cataliza la reacción 10, los sustratos son el
fosfoenolpiruvato y el ADP, los productos son el ATP y el piruvato.
f) Se denomina fosforilación a nivel del sustrato ya que se transfiere un grupo
fosforilo del 1,3-bifosfoglicerato al ADP o del fosfoenolpiruvato al ADP.
Recordemos (taller 1) que el 1,3-bifosfoglicerato y el fosfoenolpiruvato son
moléculas de alta energía, cuya energía libre de hidrólisis es mayor a la
energía libre de la reacción de síntesis de ATP a partir de ADP y Pi.
El otro mecanismo es la fosforilación oxidativa y la estudiaremos en el taller
5.
2. Plantee el balance global de la glucólisis e indique:
a) ¿Por qué se obtienen 2 moléculas de ATP por molécula de glucosa si en la fase de
beneficio se generan 4 moléculas de ATP?
b) ¿Cuántas moléculas de ATP y cuántas de NADH se obtienen si se oxidan 15 moléculas
de glucosa en la vía glucolítica?
a) En la fase preparatoria de la glucólisis se consumen 2 moléculas de ATP, y en la fase de
beneficio se forman 4 moléculas de ATP. Restando las moléculas que se consumieron a las
que se generaron, da un total de 2 moléculas de ATP por molécula de glucosa convertida en
piruvato en la glucólisis.
b) Por cada molécula de glucosa se obtiene 2 ATP y 2 NADH. Por lo tanto a partir de 15
moléculas de glucosa se obtendrán 30 ATP y 30 NADH.
3. Con el objetivo de estudiar termodinámicamente la vía se determinaron los valores de
variación de energía libre (ΔG) para todas las reacciones en el músculo cardíaco. En la
tabla se presentan estos valores y las variaciones de energía libre estándar a pH 7 (ΔG
o
’).
Reacción
Enzima
ΔG
o
’ (kJ/mol)
ΔG (kJ/mol)
1
Hexoquinasa
-20.9
-27.2
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2
Fosfoglucosa isomerasa
+2.2
-1.4
3
Fosfofuctoquinasa
-17.2
-25.9
4
Aldolasa
+22.8
-5.9
5
Trisosa fosfato isomerasa
+7.9
+4.4
6+7
G-3-P Deshidrogenasa
+ Fosfogliceratoquinasa
-16.7
-1.1
8
Fosfoglicerato mutasa
+4.7
-0.6
9
Enolasa
-3.2
-2.4
10
Piruvato quinasa
-23.0
-13.9
a) ¿Qué reacciones se encuentran cercanas al equilibrio y cuáles se encuentran alejadas
del equilibrio en el músculo cardíaco?
b) ¿Qué enzimas serían candidatas a controlar el flujo de metabolitos por la glucólisis?
¿Cómo se regulan?
c) ¿Cómo se explica la diferencia de energía en condiciones estándar y fisiológicas, de la
reacción catalizada por la aldolasa?
a) Para analizar lo que ocurre en el músculo cardíaco, hay que considerar la energía libre de
Gibbs real (
ΔG) y no en condiciones estándar. Las que tienen un ΔG cercano a 0 kJ/mol, se
encuentran cercanas al equilibrio. Por ej. reacciones 2, 6+7, 8 y 9.
b) Las reacciones que están alejadas del equilibrio y son exergónicas (ΔG << 0, reacciones
irreversibles), suelen estar catalizadas por enzimas reguladoras. La conversión de los
reactivos en productos depende de la actividad de la enzima y por eso se encuentran
alejadas del equilibrio. Para la glucólisis serían las reacciones 1, 3 y 10 que corresponden a
las enzimas hexoquinasa o glucoquinasa, la PFK1 y la piruvato quinasa. Recomendamos la
lectura del capítulo de glucólisis para ver las diferentes formas de regulación de las enzimas.
c) La diferencia está dada por las condiciones en las que se determinan los valores de la
energía libre de Gibbs. En condiciones estándar las concentraciones son 1 M para productos
y reactivos, mientras que en condiciones fisiológicas las concentraciones son las que hay en
la célula. Recordamos que la variación de la energía libre de Gibbs (ΔG) depende de ΔG
o
’ y
también la relación de la relación de acción de masas ([P]/[R]).
4. La primera reacción de la glucólisis (o vía glucolítica) es la fosforilación de la glucosa a
glucosa-6-fosfato, catalizada por la enzima hexoquinasa. Existen cuatro isoformas de la
hexoquinasa (I a IV). Las isoformas I a III están presentes en la mayoría de los tejidos y
tienen propiedades cinéticas similares. Mientras que la hexoquinasa IV o glucoquinasa,
predominante en hepatocitos y células beta de los islotes de Langerhans del páncreas,
presenta características diferentes en sus parámetros cinéticos y su regulación.
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a) Analice la gráfica de velocidad inicial (vo) en función de la concentración de glucosa
en sangre para la hexoquinasa y la glucoquinasa. ¿Qué diferencias observa?
b) El valor normal de la glicemia en ayunas se encuentra entre 3,9 y 5,6 mM. ¿Qué
efecto tiene un aumento de la concentración de glucosa en sangre a 7 mM en la
actividad de cada isoforma?
c) Analice las diferencias en los parámetros cinéticos de la hexoquinasa (eritrocito) y la
glucoquinasa (hígado) considerando el rol que cumplen en los tejidos en los que se
encuentran.
d) Analice las diferencias en la regulación de la hexoquinasa (eritrocito) y la glucoquinasa
(hígado) considerando el rol que cumplen en los tejidos en los que se encuentran.
a) Se observa que la hexoquinasa tiene un KM inferior al que presenta la glucoquinasa.
b) La hexoquinasa, se encuentra saturada y actúa cerca de su Vmax a la concentración
de glucosa presente en sangre en ayunas. Por lo tanto, un aumento de la glucosa en
sangre no genera un cambio en la velocidad de reacción. Para el caso de la
glucoquinasa, un aumento de la concentración de glucosa en sangre aumenta la
velocidad de la misma, ya que la enzima no está saturada.
c) y d) En la reacción catalizada por estas enzimas la glucosa se fosforila a glucosa
6-fosfato. La glucosa fosforilada queda dentro de la célula, ya que no hay
transportador de glucosa-6-fosfato.
El eritrocito utiliza la glucosa para obtener ATP, la enzima se encuentra siempre
saturada y la reacción transcurre a Vmax para retener a la glucosa que ingresa a la
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célula. La velocidad solo disminuye cuando la concentración de glucosa 6-fosfato
aumenta, ya que la hexoquinasa presenta inhibición por producto.
El hígado cumple un rol manteniendo la concentración de glucosa en sangre
(glicemia). Como la glucoquinasa no se encuentra saturada la velocidad de la
reacción varía de acuerdo a la concentración de glucosa en sangre. Cuando la
concentración de glucosa en sangre es elevada, la glucoquinasa fosforila y retiene a
la glucosa en los hepatocitos, y contribuye a disminuir la glicemia. En cambio cuando
la glicemia es baja, la glucoquinasa actúa a velocidades muy bajas y el hígado no
consume glucosa. La glucoquinasa no se inhibe frente a un aumento de la
glucosa-6-fosfato (su producto), ya que la glucosa 6-fosfato puede ser utilizada para
la síntesis de glucógeno u otras rutas.
En el el capítulo 15 del Lehninger (Capítulo que se encuentra en EVA), encontrará
más información sobre la regulación de estas enzimas, debe ir a leer del mismo.
5. Analice la reacción que cataliza la enzima Fosfofructoquinasa -1 (PFK-1).
a) ¿Cuáles son los productos y cuáles son los sustratos de la enzima?
b) ¿Qué rol juega la PFK-1 en la glucólisis?
a) Los sustratos de la enzima son la fructosa 6-fosfato y el ATP. Mientras que los
productos la fructosa 1,6-bifosfato y el ADP.
b) La PFK1 cataliza la reacción irreversible que define que la glucosa será consumida en
la glucólisis y es una enzima reguladora de la vía. Se recomienda leer el capítulo 15
del Lehninger que cuenta con la información sobre su regulación.
6. Para estudiar la cinética enzimática de la PFK-1 se determinó la velocidad de la reacción
catalizada por la enzima (0.1 µg/ml) a pH 7.0, variando la concentración de F-6-P y con una
concentración fija de ATP (3 mM).
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a) ¿Cómo es la cinética de la PFK-1 en función de F-6-P?
b) ¿Cómo es la unión de la F-6-P a la enzima?
c) Estime el valor del K
0.5.
a) Tiene una cinética del tipo sigmoide (no Michaeliana).
b) Es del tipo cooperativa, eso quiere decir que cuando se une un sustrato a un sitio
activo modifica el resto de los sitios activos de la enzima aumentando su afinidad por
el sustrato.
c) El K
0.5.
aproximado es de 7 mM.
7. Se determinó la velocidad de la reacción catalizada por la PFK-1 (0.1 µg/ml) a pH 7.0,
variando la concentración de ATP o GTP a una concentración fija de F-6-P (2 mM).
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a) Analice el comportamiento de la enzima al utilizar como sustrato ATP o GTP.
b) La concentración intracelular de ATP en estado estacionario es de 2.5 - 5 mM según
el tipo celular. ¿Cómo será la actividad de la enzima en esas condiciones?
c) Si la concentración intracelular de ATP disminuye de 3 mM a 1 mM ¿qué sucede con
la actividad de la PFK-1?
a) La PFK-1 puede utilizar tanto el ATP como GTP como sustratos. El ATP además de ser
sustrato, es un modulador alostérico negativo de la enzima.
b) La actividad de la enzima es muy baja a estas concentraciones.
c) La actividad de la enzima aumenta ya que disminuye la concentración del modulador
negativo.
8. Se realizaron diferentes curvas de velocidad en función de [F-6-P] en presencia de la PFK-1
a pH 7.0 a diferentes concentraciones de citrato.
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a) ¿Cuál es el efecto del citrato sobre los parámetros cinéticos de la PFK-1?
b) ¿Cómo describiría el rol del citrato?
a) El citrato aumenta el K
0.5.
de la enzima.
b) El citrato es un modulador negativo de la enzima. El citrato se acumula en la mitocondria
cuando los niveles de NADH aumentan y se detiene el ciclo de Krebs. El citrato sale por un
transportador hacia el citosol cuando se acumula en la mitocondria e inhibe a la enzima.
9. La fructosa-2,6-bifosfato es un metabolito cuya concentración en el hígado cambia en el
ayuno y después de una comida.
a) ¿Cuál es el efecto de un aumento de la fructosa-2,6-bifosfato sobre la actividad de PFK-1
en el hepatocito?
b) Indique cómo se produce la fructosa-2,6-bifosfato y cómo se descompone.
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a) La fructosa 2, 6 bifosfato es un modulador alostérico positivo de la PFK-1 en el
hepatocito.
b) La formación y descomposición de la Fructosa 2,6 bifosfato se regula por la
actividad de la enzima PFK-2/FBPasa. Esta enzima bifuncional presenta
actividad quinasa o fosfatasa dependiendo de su estado de fosforilación,
como se muestra en la figura de arriba.
10. Ponga en común el efecto de las moléculas sobre la velocidad de la reacción catalizada
por la PFK-1.
Modulador
Positivo/Negativo
Efecto sobre K
0,5
Citrato
Negativo
Aumenta
ADP
Positivo
Disminuye
ATP
Negativo
Aumenta
AMP
Positivo
Disminuye
Fructosa-2,6-bifosfato
Positivo
Disminuye
a) ¿Qué tipo de regulación presenta esta enzima?
b) Analice cual es la importancia de la regulación de la glucólisis por estos metabolitos.
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a) La PFK-1 presenta regulación alostérica y regulación a nivel de la expresión génica.
b) Por un lado, el ATP y sus productos de hidrólisis (el ADP y el AMP) son indicadores del
estado energético celular, por lo tanto cuando hay ATP suficiente en la célula la inhibición de
la PFK-1 produce un descenso en el flujo de metabolitos por la vía. El ADP y el AMP indican
una disminución de la concentración de ATP y por lo tanto aumentan la actividad de la PFK-1
y de la glucólisis con el fin de obtener ATP. El citrato es un intermediario del ciclo del ácido
cítrico que es liberado al citosol desde la mitocondria cuando la célula tiene un nivel elevado
de ATP, su efecto es inhibir la glucólisis.
La concentración de fructosa 2,6 bifosfato está regulada por los niveles de glucosa en sangre,
las hormonas insulina y glucagón regulan la fosforilación/desfosforilación de la PFK-2
aumentando o disminuyendo los niveles de este modulador. Esta regulación es importante
en los hepatocitos.
11. El gen PK-LR codifica a la piruvato kinasa (PK) del eritrocito y la PK de hígado. Se han
detectado varias mutaciones en este gen que afectan la actividad de la enzima. La
deficiencia en la actividad PK afecta gravemente la síntesis de ATP en el eritrocito y en
muchos casos conduce a la aparición de anemia hemolítica crónica. A continuación se
presentan los parámetros cinéticos de la PK salvaje (wild type) y la PK con una mutación,
que conduce a la sustitución de una arginina por una glutamina en la posición 510
(Arg510Gln). Los datos fueron obtenidos en presencia o ausencia de
Fructosa-1,6-bifosfato, un modulador alostérico de la PK.
Enzima
Sin Fructosa 1,6-bifosfato
K
M
(mM)
Wt
1.10
Mutante
(Arg510Gln)
1.6
a) ¿Qué tipo de modulador alostérico es la Fructosa 1,6-bifosfato? ¿Qué efecto tiene
sobre los parámetros cinéticos de la enzima?
b) ¿Qué impacto tiene la mutación sobre la enzima?
c) ¿La disminución en la actividad de la PK afecta de igual manera a un eritrocito que a
un hepatocito? ¿Por qué?
d) ¿Existen otros mecanismos de regulación de la PK en los distintos tejidos?
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a) La Fructosa 1,6-bifosfato es un modulador alostérico positivo, como se ve en la tabla,
la presencia de este metabolito disminuye el KM de la enzima.
b) La mutación produce un aumento del KM tanto en ausencia como en presencia del
modulador. Es decir disminuye la afinidad de la enzima por el sustrato.
c) La mutación en la PK afecta más a un eritrocito que a un hepatocito porque el
eritrocito depende exclusivamente de la glucólisis para la generación de ATP. El
hepatocito en cambio puede utilizar otros nutrientes, además de la glucosa, para
obtener energía por ejemplo los ácidos grasos.
d) La PK es inhibida alostéricamente por ATP, acetil CoA y ácidos grasos de cadena larga.
La isoforma hepática de la PK presenta también modulación covalente. La
fosforilación produce una inactivación de la enzima, mientras que la desfosforilación
la activa. La fosforilación y desfosforilación son reguladas por las hormonas insulina y
glucagón en respuesta a los niveles de glucosa en sangre.
Destinos del piruvato.
12. La glucólisis es una vía central del metabolismo energético de la gran mayoría de las
células. La secuencia de reacciones desde la glucosa hasta el piruvato es similar en las
células de todos los organismos. Por el contrario, el destino del piruvato puede variar
según el tipo celular e incluso para una misma célula según las condiciones metabólicas o
del entorno.
A continuación se esquematiza la vía glucolítica y los 3 destinos más importantes del
piruvato:
a. ¿Qué metabolito es el compuesto “X” del esquema?
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b. ¿Cuáles son las enzimas (A, B y C) que catalizan las reacciones que determinan que
el piruvato tenga diferentes destinos?
c. Proponga un tipo celular o situación metabólica en la que puede ocurrir cada una
de estas reacciones.
d. ¿Qué ocurre con el NAD
+
generado en las vías A y B?
e. ¿Qué ocurre con el NADH generado en C?
f. Durante la actividad intensa el tejido muscular demanda altas cantidades de ATP
comparado con el tejido en reposo. Determine cuál será el destino mayoritario del
piruvato en esta situación y cómo se produce ATP en este caso.
g. ¿Si el músculo esquelético fuera desprovisto de la enzima encargada de reducir el
piruvato, podría generar ATP a alta velocidad por la glucólisis, y llevar a cabo
actividad física intensa? Explique.
h. Existen diferentes mutaciones en el gen que codifica para la enzima C. ¿Cuáles
serán los tejidos más afectados en esos casos? ¿Por qué?
a) La X corresponde al gliceraldehído 3-fosfato un azúcar de 3 carbonos.
b) La enzima A es la lactato deshidrogenasa participa en la fermentación láctica. La
enzima B es la piruvato descarboxilasa, cataliza el primer paso de la fermentación
alcohólica. La enzima C es el complejo piruvato deshidrogenasa.
c) La fermentación láctica (A) ocurre en células que no tienen mitocondrias (por ej. el
eritrocito) o cuando el complejo piruvato deshidrogenasa se encuentra inhibido (por
ej. por acumulación de NADH en condiciones de hipoxia en el músculo, o por
mutaciones en el gen que codifica a la proteína).
La oxidación del piruvato a acetil-CoA (C) ocurre en células que tienen mitocondrias
(la mayoría de las células del organismo). Por ejemplo en el músculo cuando se
necesita ATP en condiciones aeróbicas.
La fermentación alcohólica (B) ocurre en algunos microorganismos como las
levaduras en condiciones anaeróbicas o cuando los niveles de glucosa son elevados.
d) El NAD+ es sustrato de la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH),
que cataliza el paso 6 de la glucólisis. El NAD+ generado en la fermentación es
necesario para que la glucólisis pueda llevarse a cabo.
e) El NADH generado por el complejo piruvato deshidrogenasa es un sustrato de la
cadena de transporte de electrones (cadena respiratoria) mitocondrial La oxidación
del NADH por el O2 en la cadena respiratoria se acopla a la síntesis de ATP en la
fosforilación oxidativa.
f) Durante la actividad muscular intensa la principal fuente de ATP es la fermentación
láctica, debido a que produce ATP de manera más rápida y a que la disponibilidad de
oxígeno en el músculo es limitada. El producto mayoritario es el lactato, el cual
puede convertirse nuevamente en glucosa en el hígado.
g) Si el músculo fuera desprovisto de la enzima lactato deshidrogenasa no podría
realizar actividad intensa ya que no podría se podría regenerar el NAD+ citosólico. La
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disminución del NAD+ produciría una inhibición de la glucólisis en el paso 6 (reacción
catalizada por la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa).
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