IMPORTANCIA DEL CA<SUP>2+</SUP> DEL RETICULO SARCOPLASMICO EN EL MUSCULO LISO DE LAS VIAS AEREAS

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Introducción
Hace más de un siglo, Sidney Ringer demostró que la contracción del músculo cardiaco depende de la presencia de calcio (Ca²⁺) en el medio. Desde entonces se ha descubierto que este catión participa como segundo mensajero en una gran cantidad de procesos celulares. Por ejemplo, en el músculo liso de las vías aéreas (MLVA) el incremento en la concentración de Ca²⁺ libre intracelular ([Ca²⁺]i) es primordial para iniciar la contracción (Kajita y Yamaguchi, 1993; Cuthbert y cols., 1994). Este incremento induce la interacción de la calmodulina con la subunidad catalítica de la cinasa de la cadena ligera de miosina. La formación del complejo Ca²⁺-calmodulina-cinasa de la cadena ligera de miosina permite la fosforilación de la cadena ligera de miosina 20-kDa en el sitio de la serina 19. Esta fosforilación produce una cadena de eventos que comienza con la activación de la adenosintrifosfatasa de miosina, facilitando la interacción de los filamentos de actina y miosina e iniciando el desarrollo de tensión muscular (Giembycz y Raeburn, 1992; Rodger, 1985). Se ha observado que durante la estimulación del MLVA por un agonista, como la acetilcolina o la histamina, se produce un pico transitorio de Ca²⁺, seguido de la disminución del catión hasta alcanzar una meseta (Kajita y Yamaguchi, 1993). Sin embargo, a pesar de la reducción de las concentraciones intracelulares de Ca²⁺, la tensión se mantiene hasta alcanzar su respuesta máxima (Takuwa y cols., 1987; Yang y cols., 1993; Croxton y cols., 1998; Murahashi y cols., 1999; Yoshimura y cols., 2001). Finalmente, cuando el estimulo termina, la cinasa de la cadena ligera de miosina 20-kDa se desfosforila y el músculo se relaja. El Ca²⁺ es entonces un mensajero capaz de iniciar las señales en cascada involucradas en la contracción.En las células de MLVA existen dos fuentes de Ca²⁺ íntimamente asociadas, el espacio extracelular y los almacenes intracelulares. De los últimos, el retículo sarcoplásmico (RS) es el más importante para iniciar la respuesta de contracción (figura 1; Marthan y cols., 1987; Amrani y cols., 1995; Bazán-Perkins y cols., 1998).

Figura 1. Modelo esquemático de un fragmento de membrana celular del músculo liso de las vías aéreas. En los cuadros blancos se encuentra la concentración aproximada de Ca²⁺ y las áreas azules representan el Ca²⁺ respecto de la célula. Las bombas de Ca²⁺ se muestran con círculos verdes cruzados por una flecha. La marca central verde muestra la bomba de Ca²⁺ plasmática; la marca amarilla, la del RS. Los canales de Ca²⁺ son representados con círculos rojos. DV, canal dependiente de cambios de voltaje. OR, canal operado por receptor. EC, canal activado durante la entrada capacitativa de Ca²⁺. IP₃ y ryanodina, receptor-canal sensibles a IP₃ y ryanodina, respectivamente. M₂ y M₃, receptores muscarínicos del tipo 2 y 3, respectivamente. H₁, receptor histaminérgico del tipo 1. G_o, G_q y G_i, proteínas G. PLC, fosfolipasa C.

Ambas fuentes utilizan canales permeables a Ca²⁺. En la membrana plasmática estos canales son los catiónicos inespecíficos operados por receptor y los tipo L y T dependientes de cambios de voltaje (Kotlikoff, 1988; Janssen, 1997); mientras que el Ca²⁺ concentrado en el RS puede liberarse al citoplasma mediante dos tipos de receptor-canal catiónicos no selectivos (Taylor y Traynor, 1995). Uno es sensible al inositol 1,4,5 trifosfato (IP₃), un mensajero que se forma por la activación de un receptor de membrana acoplado a una proteína Gq activando a la fosfolipasa Cß que hidroliza al fosfatidilinositol 4,5 bifosfato en IP₃ y 1,2 diacilglicerol (Berridge, 1993; Challis y cols., 1993). El otro receptor-canal es sensible a la ryanodina, un alcaloide de la raíz de Ranya speciosa. Este receptor se activa fisiológicamente cuando las [Ca²⁺]i se incrementan (Iino, 1989; Zucchi y Ronca-Testoni, 1997). Farmacológicamente, los receptores sensibles a ryanodina se pueden manipular con cafeína, que los sensibiliza para que se abran a [Ca²⁺]i basales (Iino, 1989; Iino, 1990; Pessah y col., 1987).Una de las peculiaridades del Ca²⁺ es que es el único segundo mensajero que no se puede metabolizar, así que la célula mantiene las [Ca²⁺]i basales (~150 nM) gracias a la activación de las bombas de Ca²⁺ plasmática y del RS, y en menor grado del intercambiador Na⁺/Ca²⁺ y los intercambiadores de la mitocondria (Drummond y Fay, 1996; Amrani y cols., 1995; Janssen y cols., 1997).En resumen, la contracción del MLVA producida por agonistas usualmente es el resultado de la combinación de la liberación del Ca²⁺ del RS y la entrada de Ca²⁺ extracelular. Posteriormente, el impacto del incremento en las [Ca²⁺]i es modulado por la captura del ion por el RS, la mitocondria y la salida de Ca²⁺ al medio extracelular. El RS es entonces un elemento muy importante en la excitabilidad del MLVA.Importancia del Ca²⁺ del RS en el MLVA

Debido a que el RS almacena altas concentraciones de Ca²⁺ (figura 1), la liberación de este ion del RS amplifica la magnitud de las respuestas fisiológicas (Montaño y cols., 1996; Bazán-Perkins y cols., 1998). Sin embargo, es probable que el RS tenga también un papel antagónico temporal en la excitabilidad del MLVA. En células disgregadas de músculo liso traqueal de bovino hemos observado que el estimulo continuo con cafeína induce el vaciado del Ca²⁺ del RS (Bazán-Perkins y cols., 2000). Como consecuencia, una vez que la cafeína es retirada, el RS se rellena con Ca²⁺ citoplasmático, produciendo una caída abrupta en las [Ca²⁺]i (figura 2; Friel y Tsien, 1992; Ganitkevich e Isenberg, 1992; Baró y cols., 1993; Yoshikawa y cols., 1996; Sims y cols., 1996; Bazán-Perkins y cols., 2000).

Figura 2. Registro original del efecto de la cafeína en los niveles de Ca²⁺ libre intracelular [Ca²⁺]i de células aisladas de músculo liso traqueal de bovino. Las células se obtuvieron mediante disgregación enzimática con colágeno y elastina. El Ca²⁺ se determinó utilizando la técnica de microfluorescencia utilizando como colorante al Fura-2/AM. En la parte superior se muestran los registros de fluorescencia a 340 y 380 nm. En la parte inferior el incremento transitorio de las [Ca²⁺]i inducido por la cafeína (10 mM), seguido por el decremento de las [Ca²⁺]i. Un segundo estímulo produce una respuesta similar. (Tomado de Bazán-Perkins y cols., 2000).

Posteriormente, la célula inicia una lenta recuperación hacia los niveles basales de Ca²⁺ (Bazán-Perkins y cols., 2000). Asimismo, nosotros encontramos que después del estímulo con cafeína no hay respuesta al carbacol (agonista colinérgico, figura 3).

Figura 3. Registro original del efecto del vaciado del RS con cafeína (10 mM) en la respuesta al carbacol (10 µM) en células aisladas de músculo liso traqueal de bovino.

Una posible explicación a este fenómeno podría ser que la inhibición de la fosfodiesterasa, inducida por la cafeína, ocasione la acumulación de AMPc y en consecuencia bloquee la respuesta al carbacol. Sin embargo, como se muestra en la figura 4, la administración de forskolina (un activador de la adenililciclasa) en las mismas condiciones en que se aplicó cafeína sólo disminuyó en un 50% la respuesta al carbacol.

Figura 4. Registros originales del efecto de la forskolina, agonista de la adenilato ciclasa (enzima que sintetiza al AMPc), en la respuesta de contracción inducida por KCl 60 mM en tiras de músculo liso traqueal de bovino y en la movilización de Ca²⁺ de células de músculo liso traqueal de bovino estimuladas con carbacol. A, efecto de la cafeína (10 mM) en la respuesta de contracción máxima al KCl 60 mM (n = 3). B, curva concentración respuesta de la forskolina sobre la respuesta máxima al KCl 60 mM (n = 3). C, efecto de la incubación de la forskolina 32 µM (IC₈₀) en la respuesta al carbacol (10 µM, Cch) en una célula. Como podemos observar, la administración de forskolina durante el mismo periodo de incubación con cafeína correspondiente a la figura 3 no bloquea totalmente la respuesta al carbacol.

Por lo tanto, podríamos decir que la acumulación de AMPc inducida por la cafeína no es el responsable de inhibir totalmente la respuesta al carbacol. Así concluiríamos que cuando el RS se reabastece de Ca²⁺ podría existir una restricción temporal en las respuestas de las células de MLVA que dependan de este ion. Esta restricción parece depender de la magnitud con la cual el agonista produce el vaciado del Ca²⁺ del RS y la entrada de Ca²⁺ a la célula podría tener un efecto de atenuación. De esta manera, la liberación del Ca²⁺ del RS por diferentes agonistas puede amplificar una respuesta al contribuir con el incremento de las [Ca²⁺]i. Y posteriormente, cuando el RS retoma Ca²⁺, podría haber una restricción temporal de las señales dependientes de este ion.Recientemente nosotros observamos que la eliminación del Ca²⁺ del medio extracelular bloquea completamente la recuperación de los niveles basales de Ca²⁺ por el vaciado del RS después de la estimulación con cafeína, sugiriendo que la fuente de Ca²⁺ utilizada es extracelular (Bazán-Perkins y cols., 2000). Exploramos la posibilidad de que los canales tipo L y tipo T, uno de los principales accesos de Ca²⁺ en estas células (Bourreau y cols, 1991), estuvieran involucrados en la recuperación, pero su inhibición no produjo ningún efecto. También descartamos que el intercambiador Na⁺/Ca²⁺ participe en este fenómeno (Bazán-Perkins, 2000).Actualmente estamos evaluando la posibilidad de que en esta recuperación intervenga un mecanismo de entrada de Ca²⁺ adicional a los previamente descriptos. En 1986 Putney demostró, en células no excitables, que cuando se vacía el contenido de Ca²⁺ del retículo endoplásmico se activa una señal, hasta ahora desconocida, que permite el ingreso de Ca²⁺ hasta llenar el almacén. Este fenómeno, conocido como "entrada capacitativa de Ca²⁺", ha sido observado en el MLVA del hombre (Amrani y cols., 1995). Por lo tanto es posible que la entrada capacitativa participe en la recuperación de los niveles basales de Ca²⁺ citoplasmático después de la estimulación con cafeína.Por otro lado, adicionalmente a las funciones ya descriptas, al RS se le ha atribuido otro papel en relación a la regulación del Ca²⁺ debido a su ubicación cerca de la membrana plasmática (Gabella, 1983). En 1995, van Breemen y colaboradores propusieron que, en el músculo liso vascular, el RS podría funcionar como una barrera superficial amortiguadora (BASA) de Ca²⁺ entre el medio extracelular y el mioplasma. En este modelo, el Ca²⁺ entra primero al espacio subplasmático, zona localizada entre el RS y la membrana plasmática, y pasa al RS antes de difundirse hacia el mioplasma. Recientemente, Janssen y cols. (1999) describieron este mismo fenómeno en el MLVA de perro. Nosotros observamos, en células aisladas de MLVA de bovino, que la perfusión de las células con medio sin Ca²⁺ genera disminución continua de las [Ca²⁺]i hasta producir un nuevo estado basal (figura 5; Bazán-Perkins y cols., 2000).

Figura 5. Dependencia del contenido de Ca²⁺ del RS en el decremento de las [Ca²⁺]i basales de células aisladas de músculo liso (ML) traqueal de bovino incubadas en medio sin Ca²⁺. Registros originales que representan: A, miocitos incubados en medio sin Ca²⁺. B, miocitos estimulados con cafeína (10 mM) e incubados en medio sin Ca²⁺. C, curso temporal del decremento de las [Ca²⁺]i de las células incubadas en medio sin Ca²⁺ sin estímulo (n = 7, círculos blancos) y las estimuladas con cafeína (n = 9, círculos negros). *, p < 0.05 (tomado de Bazán-Perkins y cols., 2000).

De manera simultánea, el contenido de Ca²⁺ del RS también fue disminuyendo. Esto podría sugerir que tanto en la membrana plasmática como en la del RS de estas células hay una salida importante de Ca²⁺ y que, debido a que no observamos que se modifique al inactivar los canales dependientes de voltaje, ésta no depende del potencial de membrana. También observamos que la salida de Ca²⁺ de la célula fue más rápida cuando el contenido del ion en el RS fue vaciado con la estimulación con cafeína (figura 5; Pessah y cols., 1987; Baró y cols., 1993). Esto parece indicar que la BASA de Ca²⁺ también puede funcionar en el sentido inverso, esto es, que el RS podría amortiguar la salida del ion de la célula y por eso, cuando éste es vaciado con cafeína, el RS reduce su capacidad de amortiguación y el Ca²⁺ citosólico se sale fácilmente de la célula en el medio sin Ca²⁺.En conclusión, el RS, además de funcionar como una BASA de Ca²⁺, podría modificar las respuestas celulares al amplificar o restringir transitoriamente las señales que dependan de Ca²⁺. El RS es entonces un elemento importante de la excitabilidad del MLVA.Glosario:
AMPc, monofosfato de adenosina cíclico. [Ca²⁺]i, concentración de calcio libre intracelular. IP₃, inositol 1,4,5 trifosfato. RS, retículo sarcoplásmico.

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